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幾經(jīng)調(diào)整，新型冠狀病毒被世界衛(wèi)生組織（WHO）命名為SARS-CoV-2，2019-nCoV成為舊稱。此前不久，國(guó)家衛(wèi)健委將這種新型病毒導(dǎo)致的疾病命名為為COVID-19。人類對(duì)這個(gè)庚子新春突襲中國(guó)大地的病毒的認(rèn)識(shí)仍在基于陸續(xù)公布的新發(fā)現(xiàn)而變得逐漸清晰，SARS-CoV-2的最后定名也需要等待國(guó)際病毒分類委員會(huì)在今年6月前后開(kāi)會(huì)正式?jīng)Q定。

根據(jù)科學(xué)家們目前掌握的情況，SARS-CoV-2屬于有包膜的β屬冠狀病毒，遺傳物質(zhì)為由接近3萬(wàn)個(gè)堿基組成的單條正義RNA鏈，RNA由表面布滿刺突蛋白（S Protein）的蛋白質(zhì)外殼包裹，這些刺突蛋白是SARS-CoV-2侵染宿主細(xì)胞的關(guān)鍵，其具有高度傳染性。2月20日出版的《科學(xué)》雜志上有文章稱，科學(xué)家們利用冷凍電鏡技術(shù)解析刺突蛋白分子結(jié)構(gòu)后發(fā)現(xiàn)，SARS-CoV-2的刺突蛋白通過(guò)與人體細(xì)胞的ACE2受體作用從而入侵細(xì)胞，其與ACE2的親和力是SARS病毒的10~20倍，這在一定程度上解釋了其高度傳染性。

對(duì)于這類高傳染性的、尚存在知識(shí)盲點(diǎn)的病毒，借助精準(zhǔn)快速診斷、快速篩查分流、切斷傳播源、防范交叉感染，無(wú)疑是控制疫情發(fā)展的關(guān)鍵。臨床上最常用的病原體快速檢測(cè)技術(shù)主要包括兩大類，即核酸檢測(cè)和抗原抗體檢測(cè)（我們?cè)谇捌诘奈恼轮羞M(jìn)行過(guò)梳理）。核酸（DNA或RNA）作為病毒的遺傳物質(zhì)，任何物種都有獨(dú)一無(wú)二的核酸序列，對(duì)樣本中核酸特征序列進(jìn)行檢測(cè)便可確定病原體。

目前，核酸檢測(cè)方法主要包括PCR法、恒溫?cái)U(kuò)增法、測(cè)序法、CRISPR檢測(cè)法等。其中，第二代PCR技術(shù)是病毒檢測(cè)方法的主流方法，也是目前官方認(rèn)可的SARS-CoV-2測(cè)定方法。第二代PCR技術(shù)，又稱熒光PCR法，是指在反應(yīng)體系中加入了熒光物質(zhì)，通過(guò)專門(mén)儀器實(shí)現(xiàn)實(shí)時(shí)熒光檢測(cè)，并對(duì)模板進(jìn)行定量計(jì)算。為了增加靈敏度和特異性，熒光PCR法出現(xiàn)了不少改進(jìn)版本，包括Taqman探針?lè)ā㈦p重或多重?zé)晒釶CR等。

盡管存在“假陰性”質(zhì)疑，核酸檢測(cè)至少在SARS-CoV-2防控中仍然被作為診斷金標(biāo)準(zhǔn)。國(guó)務(wù)院相關(guān)負(fù)責(zé)人在聯(lián)防聯(lián)控新聞發(fā)布會(huì)上曾表示，會(huì)將推動(dòng)新的快速檢測(cè)方法在更基層的地方使用，讓不具備較高醫(yī)療條件的地方也能開(kāi)展核酸檢測(cè)作為下一步要做的工作。

在動(dòng)脈網(wǎng)根據(jù)公開(kāi)資料整理的115家企業(yè)研發(fā)的116個(gè)SARS-CoV-2病毒核酸檢測(cè)試劑盒中，98個(gè)試劑盒選擇了熒光PCR技術(shù)，基于上述方法試劑盒也均有出現(xiàn)。

不同原理試劑盒類型分布  數(shù)據(jù)來(lái)源：動(dòng)脈網(wǎng)根據(jù)公開(kāi)資料整理

熒光PCR法是主流，2~3小時(shí)完成核酸檢測(cè)

PCR，即聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，是對(duì)待檢測(cè)樣本中的核酸進(jìn)行擴(kuò)增的一種方法。熒光PCR法，又稱qPCR法（Quantitative Real-time PCR, qPCR），是生物分子熒光技術(shù)發(fā)展的產(chǎn)物，即指在核酸擴(kuò)增反應(yīng)的過(guò)程中，加入以熒光化學(xué)物質(zhì)，并以熒光強(qiáng)度來(lái)測(cè)定PCR循環(huán)后產(chǎn)物中核酸水平。熒光PCR的概念于1992年首次被日本科學(xué)家提及，并在4年后由美國(guó)公司ABI實(shí)現(xiàn)產(chǎn)業(yè)化。如今，ABI公司在熒光定量PCR儀制造界的地位仍不可撼動(dòng)，其三代產(chǎn)品ABI 7500 Real-time PCR system是全球使用最廣泛的熒光定量PCR儀。

據(jù)報(bào)道，2020年1月7日，中國(guó)研究者將SARS-CoV-2病毒全序列特征上傳到NIH GeneBank數(shù)據(jù)庫(kù)和GISAID數(shù)據(jù)庫(kù)供全球共享；1月21日，中國(guó)疾病預(yù)防控制中心（CDC）也在官網(wǎng)上公布了包括ORF基因和N基因在內(nèi)的幾段基因序列；因此在1月27日，在國(guó)家衛(wèi)健委發(fā)布的第四版新型冠狀病毒肺炎診療方案里提出，只要RT-PCR或測(cè)序陽(yáng)性即可確診，根據(jù)基因序列，可以配比對(duì)應(yīng)的酶和探針來(lái)檢測(cè)病毒。

期間，國(guó)內(nèi)核酸診斷試劑企業(yè)快速跟進(jìn)，以公開(kāi)的病毒序列作為靶序列，開(kāi)發(fā)針對(duì)這一病毒的診斷試劑。截至發(fā)稿，動(dòng)脈網(wǎng)從公開(kāi)找到98款已經(jīng)完成開(kāi)發(fā)的熒光PCR法SARS-CoV-2病毒的核酸檢測(cè)試劑盒，當(dāng)然還有很多在研產(chǎn)品和未公布產(chǎn)品信息的試劑盒沒(méi)有被統(tǒng)計(jì)在內(nèi)。由于篇幅限制，本文不專門(mén)列示全部核酸檢測(cè)試劑盒的相關(guān)信息，讀者若感興趣，可至專題Pro相關(guān)頁(yè)面查詢。

1月，國(guó)家藥品監(jiān)督管理局打開(kāi)了醫(yī)療器械注冊(cè)應(yīng)急審批通道。根據(jù)規(guī)定，核酸檢測(cè)試劑在疫情期間可以免臨床試驗(yàn)先上市，后補(bǔ)充臨床試驗(yàn)數(shù)據(jù)，審批有效期為1年。核酸檢測(cè)試劑盒獲國(guó)家局審批上市后，即可進(jìn)入各地醫(yī)院和逐步開(kāi)放的第三方醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)所進(jìn)行核酸檢測(cè)，對(duì)疾病預(yù)防控制中心的患病人群篩查工作形成有力補(bǔ)充。以湖北為例，目前可以進(jìn)行核酸檢測(cè)的機(jī)構(gòu)有疾控中心18家、醫(yī)院63家、第三方獨(dú)立機(jī)構(gòu)13家，其中在武漢市的醫(yī)院有25家。

下表列出了國(guó)家藥監(jiān)局審批上市的9個(gè)新冠病毒核酸檢測(cè)試劑盒中6個(gè)采用了熒光PCR法的產(chǎn)品，分別來(lái)自之江生物、華大生物、捷諾生物、伯杰生物、圣湘生物和達(dá)安基因6家研發(fā)企業(yè)。這些試劑盒多采用ORF1ab 基因和N 基因作為靶基因，據(jù)了解，ORF1ab基因特異性較強(qiáng)，而N基因在冠狀病毒內(nèi)本身相對(duì)保守，會(huì)有交叉，如229E、OC43、HKU-1等感染人但傳播能力較差的冠狀病毒檢測(cè)時(shí)也會(huì)呈現(xiàn)陽(yáng)性。

上述企業(yè)均第一時(shí)間在其公眾號(hào)推送了新產(chǎn)品獲批的消息，其迅速開(kāi)發(fā)新產(chǎn)品、充分調(diào)動(dòng)產(chǎn)能保障產(chǎn)量、整合多方渠道讓產(chǎn)品及時(shí)觸達(dá)用戶的能力，在抗擊新冠肺炎疫情的過(guò)程中發(fā)揮了舉足輕重的作用。例如，圣湘生物早在1月14日即研制出核酸檢測(cè)試劑盒。再如，達(dá)安基因從1月12日拿到病毒基因組序列，到1月28日取得試劑盒的醫(yī)療機(jī)械注冊(cè)證，歷時(shí)僅半個(gè)月，并將核心日產(chǎn)能從10萬(wàn)人份提高到20萬(wàn)人份，向全國(guó)各地供應(yīng)。

同時(shí)，我們?cè)诖壬圃�助中也頻頻看到這些企業(yè)的身影。例如，2月3日，之江生物通過(guò)中華慈善總會(huì)，在藍(lán)天救援隊(duì)的物流支持下，將第一批捐贈(zèng)物資點(diǎn)對(duì)點(diǎn)捐贈(zèng)武漢協(xié)和醫(yī)院，包括10000人份新型冠狀病毒核酸檢測(cè)試劑、配套提取試劑以及相應(yīng)自動(dòng)化配套設(shè)備；截至2月18日，華大基因已向湖北及其他省份捐贈(zèng)10.25萬(wàn)人份新冠病毒檢測(cè)試劑盒。

到今天，疫情蔓延勢(shì)頭得到初步遏制，防控工作取得階段性成效，全國(guó)多地調(diào)整了重大公共衛(wèi)生事件響應(yīng)等級(jí)，核酸檢測(cè)試劑盒仍活躍在保障企業(yè)員工復(fù)工安全的最前線。

檢出效率方面，有業(yè)內(nèi)人士向動(dòng)脈網(wǎng)表示，盡管有企業(yè)號(hào)稱能夠在半小時(shí)甚至15分鐘內(nèi)完成核酸檢測(cè)，目前獲批上市的試劑盒均需要2~3個(gè)小時(shí)才能走完核酸檢測(cè)的全部流程。該業(yè)內(nèi)人士指出，PCR最大特點(diǎn)就是實(shí)時(shí)，樣本檢測(cè)為陽(yáng)性的時(shí)間與樣本濃度相關(guān)，由于無(wú)癥狀者或輕癥者體內(nèi)濃度低，如果一味追求反應(yīng)快，可能會(huì)造成漏檢。

在本文的剩余章節(jié)，我們將對(duì)數(shù)字PCR法、測(cè)序法、CRISPR檢測(cè)法、恒溫?cái)U(kuò)增法下已經(jīng)完成研發(fā)的SARS-CoV-2病毒核酸檢測(cè)試劑盒做簡(jiǎn)單介紹。

數(shù)字PCR法

數(shù)字PCR技術(shù)是第三代PCR技術(shù)，是一種核酸分子絕對(duì)定量的檢測(cè)方法。現(xiàn)階段，核酸分子的定量有三種方法：光度法基于核酸分子的吸光度來(lái)定量；實(shí)時(shí)熒光定量PCR基于Ct值，即指可以檢測(cè)到熒光值對(duì)應(yīng)的循環(huán)數(shù)；數(shù)字PCR作為最新定量技術(shù)，主要采用當(dāng)前分析化學(xué)熱門(mén)研究領(lǐng)域的微流控或微滴化方法，借助專門(mén)設(shè)備將50微升左右核酸溶液樣本大量稀釋后，分割成了近10萬(wàn)個(gè)液滴分散至芯片的微反應(yīng)器或微滴中，單一液滴為獨(dú)立反應(yīng)單元，每個(gè)反應(yīng)器的核酸模板數(shù)少于或者等于1個(gè)。經(jīng)過(guò)PCR循環(huán)擴(kuò)增后，有一個(gè)核酸分子模板的反應(yīng)器就會(huì)給出熒光信號(hào)，沒(méi)有模板的反應(yīng)器就沒(méi)有熒光信號(hào)。根據(jù)相對(duì)比例和反應(yīng)器的體積，就可以推算出原始溶液的核酸濃度，從而實(shí)現(xiàn)樣本核酸分子絕對(duì)定量，即直接計(jì)算出核酸數(shù)量。

數(shù)字PCR法和熒光PCR法的關(guān)鍵區(qū)別在于檢測(cè)結(jié)果的絕對(duì)定量和相對(duì)定量差異。據(jù)了解，現(xiàn)階段數(shù)字PCR試劑和機(jī)器相價(jià)格加高（一臺(tái)儀器近百萬(wàn)元），在SARS-CoV-2快速檢測(cè)中的優(yōu)勢(shì)并不大。不過(guò)，由于具備自動(dòng)化程度更好、耗時(shí)更短等技術(shù)優(yōu)勢(shì)，國(guó)內(nèi)多家掌握了數(shù)字PCR技術(shù)的核酸試劑研發(fā)企業(yè)正在嘗試開(kāi)發(fā)適用于SARS-CoV-2檢測(cè)的相關(guān)試劑盒，我們將其不完整羅列如下。

測(cè)序法

測(cè)序法可直接解讀出核酸堿基的排列順序，對(duì)于一個(gè)完全未知的新病毒來(lái)說(shuō)，測(cè)序是必須的。測(cè)序技術(shù)雖然早在1977年就已發(fā)明，并在“人類基因組計(jì)劃”末期突破重要技術(shù)瓶頸開(kāi)始迅猛發(fā)展，仍只有少數(shù)企業(yè)研制出新型冠狀病毒核酸測(cè)序試劑盒并投入生產(chǎn)。

凱普生物

2月3日晚間，上市公司廣東凱普生物發(fā)布公告稱，旗下子公司潮州凱普生物化學(xué)有限公司和廣州凱普醫(yī)藥科技有限公司研發(fā)團(tuán)隊(duì)?wèi)?yīng)用熒光PCR技術(shù)和Sanger測(cè)序平臺(tái)，分別完成了新型冠狀病毒（2019-nCoV）核酸檢測(cè)試劑盒（PCR-熒光探針?lè)ǎ┖托滦凸跔畈《?019-nCoV核酸檢測(cè)試劑盒（Sanger測(cè)序法）的開(kāi)發(fā)。

此外，公司控股的廣州凱普醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)所已作為廣東省衛(wèi)健委指定的承接新型冠狀病毒樣本檢測(cè)的第三方檢驗(yàn)機(jī)構(gòu)之一，開(kāi)展相關(guān)的樣本檢測(cè)工作。武漢凱普醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)室有限公司已被湖北省新型冠狀病毒感染肺炎疫情防控指揮部列入可開(kāi)展新型冠狀病毒核酸檢測(cè)的第三方機(jī)構(gòu)名單（第一批）。

杰毅生物

杰毅生物針對(duì)新型冠狀病毒設(shè)計(jì)了全新的mNGS方案，在全面鑒定病原體的同時(shí)，特別設(shè)計(jì)了一系列新冠病毒特異性引物，并結(jié)合杰毅生物獨(dú)特的PCR-free快速建庫(kù)方法，推出了新型冠狀病毒（2019-nCoV）核酸檢測(cè)試劑盒（可逆末端終止測(cè)序法）。該試劑盒可以直接從臨床樣本開(kāi)始操作，大大提高新冠病毒核酸富集效率，在和熒光定量CT<37確診樣本對(duì)比中，不僅陽(yáng)性符合率比傳統(tǒng)mNGS從87.5%提高到100%，基因組覆蓋度更是最高達(dá)到99.8%。除試劑盒外，該解決方案配備了Cubics病原宏基因組一站式建庫(kù)儀和本地化數(shù)據(jù)分析軟件，從臨床樣本至測(cè)序文庫(kù)，全流程無(wú)人值守自動(dòng)化，用時(shí)3.5小時(shí)。

據(jù)介紹，杰毅生物的試劑盒具有自動(dòng)化、速度快、成本低、覆蓋廣的特點(diǎn)。Cubics?一站式建庫(kù)儀，具有4個(gè)獨(dú)立反應(yīng)通道，可放置在生物安全柜內(nèi)無(wú)人值守地完成核酸提取、建庫(kù)和純化的全流程。樣本進(jìn)，文庫(kù)出，有效杜絕樣本間交叉污染和實(shí)驗(yàn)人員的感染風(fēng)險(xiǎn)，測(cè)序數(shù)據(jù)分析在本地自動(dòng)化運(yùn)行，耗時(shí)1小時(shí)左右；在每個(gè)樣本測(cè)序20M（兩千萬(wàn)條）序列，75bp讀長(zhǎng)的條件下，“新冠病毒”基因組覆蓋度最高可達(dá)99.8%，顯著提高測(cè)序儀利用率，降低測(cè)序成本；除“新冠病毒”外，可同時(shí)檢測(cè)樣本中16000余種DNA病原體（細(xì)菌、DNA病毒、真菌、寄生蟲(chóng)等），對(duì)臨床重癥患者提供精準(zhǔn)和全面的感染診斷。

擁有這一最新利器組合，臨床工作者可以在18小時(shí)內(nèi)完成病原宏基因組檢測(cè)，并高效地獲取新型冠狀病毒的基因組序列信息，對(duì)研究分析病毒的進(jìn)化來(lái)源、致病病理機(jī)制、病毒變異的情況以及人與人之間傳染的能力評(píng)估是至關(guān)重要的。