病毒驅動型和致癌物驅動突變型頭頸癌的免疫狀況
2．CD8 + T細胞具有連續分化軌跡
接下來對CD8 + T細胞進行了生物信息學分離并重新聚類,得到了8個亞群(圖2A)。TIL的CD8 + T最常見于#1-4,而PBMC和tonsil的CD8 + T細胞常見于#5-8(圖2B)。圖2C為每個亞群的差異基因。
圖2C得:#1與細胞周期細胞(eg． MKI67)相關;#2與干擾素應答基因(eg． ISG15)相關;#3和4與檢查點標記(eg． PDCD1,CTLA4和HAVCR2)相關;#5表達較為靜止;#6與幼稚或記憶細胞(eg． CCR7和CD27)有關;#7與早期激活相關(eg． JUNB和FOSB);#8表達與效應功能有關(例如,KLRG1和GZMH)。
接下來,使用自主開發的新R包SingleSeqGset(https://github．com/arc85/singleseqgset)中進行競爭性基因集富集測試(competitive gene set enrichment test),評估了亞群的生物學功能。其中,#4缺氧反應有富集,而先前已經證實缺氧誘導因子可增強CD8 + T細胞效應,這表明該亞群抗腫瘤活性更高。
接下來,使用R包Destiny進行擴散映射分析(diffusion map analysis)來推斷分化軌跡。結果顯示出一條無分叉平滑軌跡(圖2E),HPV +和HPV- TIL也有重疊(圖2F)。因為DC1與抑制性受體表達以及腺苷代謝增強有關,所以認為DC1與終末分化表型密切相關 。總的來說,這個部分鑒定出CD8 + T各亞群功能,并根據HPV +和HPV-之間共有的分化軌跡,推斷針對CD8 + T細胞的免疫治療策略可能均適用于兩種HNSCC。
圖2．CD8 +T的HPV–和HPV + TIL分化軌跡以及抑制性受體的共表達
3．CD4 + Tconv的異質性和分化軌跡
接下來比較了HPV–和HPV + HNSCC之間CD4 + T細胞的轉錄情況,分別分析了CD4 + Tconv細胞和CD4 + Treg細胞。CD4 + Tconv細胞聚類出7個不同的亞群(圖3AB),#1和6大部分由HPV + TIL和tonsil組成,HPV– TILs則分布在#4和7之間。基因富集發現tonsil和TIL中的CD4 + Tconv細胞顯示出T濾泡輔助功能(TFH)和1型輔助功能(TH1)的富集,且HPV +與HPV– TIL相比,具有顯著的細胞富集,說明HPV + T細胞的效應功能更強。
圖3C為CD4 + Tconv細胞的分化軌跡,不同于CD8 + T細胞,擴散圖的前3維產生了分支軌跡(圖3C),且發現HPV–和HPV + TIL的分化平面顯著不同(圖4D)。接下來將擴散擬時間(pseudotime,DPT)作為第三維與DC1,DC2一起分析,DC1和DC2都與DPT正相關。與基因集富集分析一致,#2是最幼稚的亞群,然后通過連續的中間表型,向#1或#7終態發展。圖3E顯示了#1和7的差異基因表達,#1與TFH有關,#7與記憶性功能有關。CXCR5和PDCD1與DC1的表達有關,還發現了其他已知抑制性受體(LAG3和HAVCR2)在CXCR5和PDCD1共表達時明顯表達。這表明了早期階段的命運決定模式,過程中細胞可以發展為CD4 + TFH或者通過抑制受體共表達,從而潛在地抑制進一步分化。
圖3．A-E CD4+ Tconv的轉錄狀態和分化軌跡的分析
4．CD4 + Treg細胞中與IFN和TNFR相關的信號
CD4+ Treg細胞能抑制抗腫瘤免疫反應,其細胞聚類發現了6個亞群(圖3FG),主要由TIL細胞構成。接下來,進行了基因集富集分析,以表征每個亞群的生物活動(圖3H)。#2和4與IFNα應答相關,#3和6與TNFR家族信號通路相關,表明這些細胞根據其分化狀態對不同的信號作出反應。
CD4 + Treg細胞的擴散映射圖顯示DPT與DC1密切相關(圖3I)。沿著DC1軸,HPV–與HPV + TIL Treg細胞的密度存在細微差異,在早期DPT處,來自HPV– TIL的Treg細胞更多(圖3J)。
然后還發現TNFR與DC1正相關,并在晚期DPT表達。相反,IFN反應基因IFITM1,IFIT1,IFIT3和ISG20在早期DPT時表達,并隨著偽時間的進展而靜止,表明IFN信號在Treg細胞的早期活化中具有潛在作用。綜上所述,該分析表明,Treg細胞在HPV–和HPV + HNSCC之間具有相似的軌跡,并且在分化過程中IFN相關信號和TNFR家族信號相關,提示靶向Treg細胞的早期激活過程可以使用基于IFN的治療,而晚期激活的Treg細胞可能對TNFR介導的信號傳導更敏感。
圖3．F-J CD4+ Treg細胞的轉錄狀態和分化軌跡的分析
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