ADC中的酶可切割肽連接子
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引言
抗體偶聯藥物（ADC）作為一種強大的癌癥治療模式，其成功在很大程度上歸功于連接子系統的發展，該系統能夠在癌細胞內實現細胞毒性載荷藥物的靶向釋放。許多溶酶體蛋白酶在人類癌癥中過度表達，能有效切割多種肽序列，這一特性被用于ADC連接子系統的設計。其中，纈氨酸-瓜氨酸-對氨基芐基氨基甲酸酯連接子已在許多獲批或處于臨床前和臨床開發階段的ADC中使用。盡管ValCit-PABC及其相關連接子在溶酶體中容易被組織蛋白酶切割，同時在人類血漿中保持相當穩定，但許多研究表明它們易受小鼠和大鼠血漿中的羧酸酯酶1C的影響，這阻礙了ADC的臨床前評估。此外，ADC最常見的劑量限制性不良反應——中性粒細胞減少癥和血小板減少癥，被認為是由人中性粒細胞彈性蛋白酶對ValCit-PABC的過早水解引起的。除了ValCitPABC，GGFG四肽-氨基甲氧基連接子也是組織蛋白酶可切割的，并已用于ADC藥物DS8201a中。除了組織蛋白酶可切割的連接子，豆莢蛋白敏感連接子也日益受到ADC開發的關注。提高血漿穩定性同時保持ADC連接子的溶酶體可切割性是當前深入研究的重點。
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一、ADC的作用機制與連接子設計原理
ADC的作用機制涉及抗體與癌細胞上特定抗原的結合，隨后通過受體介導的內吞作用內化。一旦進入癌細胞，抗體在核內體-溶酶體區室中的降解和/或連接子的切割將釋放藥物載荷，隨后其在細胞質或細胞核中發揮其殺細胞作用。研究人員利用了兩個重要的核內體-溶酶體特征來設計藥物釋放的連接子系統：(i) 溶酶體內部的酸性環境用于設計酸不穩定性連接子，以及 (ii) 特定溶酶體蛋白酶的過度表達用于設計蛋白酶可切割的連接子。在17種獲批的ADC中，有9種的連接子中含有蛋白酶可識別的肽序列。連接子-載荷優化是ADC開發中最關鍵的任務之一。
溶酶體蛋白酶可切割的ValCit-PABC連接子系統在許多已獲批的ADC中使用，其在連接Cit和PABC的酰胺鍵處容易被切割，導致自消除性載荷釋放。最初認為只有組織蛋白酶B負責切割ValCit-PABC；然而，后來的基因敲除研究表明，其他組織蛋白酶，如組織蛋白酶S、L和F，也參與了切割機制。研究還揭示了多種二肽序列可以作為這些溶酶體酶的底物。在ValCitPABC連接子的初步開發之后，研究人員已經測試了大量的肽/擬肽序列，以進一步改進連接子系統。
ValCit-PABC連接子系統已被證明在人類血清中具有良好的穩定性，這是ADC在體循環中維持酶降解的最重要標準。然而，許多研究表明ValCit-PABC在小鼠血漿中不穩定，這種降解是由一種稱為羧酸酯酶C1的蛋白酶引起的。這種不穩定性阻礙了ADC的臨床前評估。此外，ADC治療通常會導致癌癥患者中性粒細胞減少。Zhao等人使用純化的中性粒細胞彈性蛋白酶評估了具有可切割纈氨酸-瓜氨酸連接子或不可切割馬來酰亞胺己酰連接子的ADC的體外穩定性，結果表明ValCit連接子容易被彈性蛋白酶切割以釋放游離MMAE，而MC連接子則不能。
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二、ValCit-PABC連接子的優化策略與結構-活性關系
1. 在P3位添加極性酸性殘基以增加血漿穩定性
ValCit-PABC連接子被設計為由組織蛋白酶B在連接P1殘基瓜氨酸和P1' PABC的酰胺鍵處切割。組織蛋白酶B是一種主要存在于溶酶體中的半胱氨酸蛋白酶。然而，研究表明ValCit-PABC可以被小鼠血漿中的Ces1C切割。在明確Ces1C介導的切割機制后，作者合成了幾種在P3位具有取代的新型連接子-載荷分子并測試了其穩定性。有趣的是，他們觀察到當某些親水基團被引入P3位時，小鼠血漿穩定性增加；特別是，2-羥基乙酰胺基團極大地提高了血漿穩定性。
受這些結果的啟發，Anami等人在P3位引入了親水性氨基酸，發現雖然SerValCit在穩定性上改善甚微，但在P3位具有酸性氨基酸的連接子，如GluValCit和AspValCit，在小鼠血漿中表現出優異的穩定性。相反，在P3位具有堿性氨基酸Lys使LysValCit連接子比母體ValCit連接子更不穩定。這表明P3位的酸性氨基酸有效地阻斷了Ces1C的接近，而堿性氨基酸增強了Ces1C與連接子之間的相互作用。重要的是，上述討論的所有連接子-載荷設計在人類血清中都非常穩定，并且它們仍然對溶酶體酶組織蛋白酶B敏感，這對于癌細胞內的藥物釋放至關重要。
2. P1位極性堿性殘基取代改善溶酶體切割活性
研究人員設計了大量的P2-P1二肽，通過取代P2-Val和P1-Cit，旨在增加連接子的溶酶體可切割性并改善其在小鼠血漿中的穩定性。當極性瓜氨酸被丙氨酸取代時，血漿穩定性進一步下降，盡管組織蛋白酶B的載荷釋放未受影響。當極性帶負電荷的天冬氨酸被引入P1位時，血漿穩定性沒有顯著變化；然而，它顯示出組織蛋白酶B的載荷釋放減少。相反，另一項關于P1氨基酸對組織蛋白酶介導切割影響的研究表明，P1位的精氨酸殘基將切割效率提高了九倍。這些結果表明，極性或堿性的P1氨基酸對于有效的載荷釋放是可取的，而酸性殘基則會降低切割效率。
3. PABC苯環上取代的影響
直接將Val-Cit連接到載荷上會導致由于載荷的位阻因素抑制組織蛋白酶與ValCit二肽的結合，從而導致較低的載荷釋放效率。當在載荷和ValCit之間添加間隔基時，這個問題得到部分解決。PABC不僅改善了組織蛋白酶的結合，而且還經歷自消除性1,6-消除以未修飾的形式釋放載荷。目前，PABC與各種載荷和肽連接子系統一起使用。
為了改善ValCit-PABC連接子系統對小鼠血漿中Ces1C的穩定性，Podule等人合成了幾種具有PABC上取代或替換的uncialamycin-連接子偶聯物，包括用噻唑等雜環替換。在PABC苯環的間位引入N-甲基羧酰胺基團時獲得了令人鼓舞的結果。所得的MA-PABC在小鼠血清中僅被切割3%，且其組織蛋白酶介導的釋放未受影響。當在相同的MA-PABC的P3位添加谷氨酸時，小鼠血清中的切割在24小時內進一步減少至7%。添加谷氨酸不僅改善了對Ces1C的穩定性，還改善了溶解度，這在疏水性載荷使用時尤為重要。作者進一步通過用2-氨基乙基及其氨基聚乙二醇化形式替換甲基來增加連接子的親水性。這些新的修飾為連接子提供了優異的小鼠和人類血清穩定性，且不影響組織蛋白酶B介導的切割。上述研究清楚地表明，結合結構-活性關系研究中的各種屬性可以產生具有高血漿穩定性同時保持組織蛋白酶敏感性的理想連接子-載荷系統。
4. 串聯可切割連接子
ValCit-PABC偶聯ADC的一個常見缺點是骨髓抑制，這很可能是由連接子的過早切割和載荷釋放引起的。為了改善ValCit-PABC-MMAE偶聯ADC的體內穩定性，Chuprakov等人開發了一種有趣的串聯可切割連接子。他們在PABC上引入了一個β-葡萄糖醛酸苷部分，作為位阻阻斷劑，以保護ValCit-PABC連接子免受循環中絲氨酸蛋白酶的影響。內化后，β-葡萄糖醛酸糖苷酶介導的β-葡萄糖醛酸苷切割將首先暴露ValCit-PABC，然后其再被組織蛋白酶切割以在癌細胞內部釋放MMAE。
所有ADC在體外針對B細胞非霍金淋巴瘤衍生的CD79b+ JeKo-1細胞進行測試時均表現出同等效力。正如預期，傳統的ValCitPABC-MMAE ADC在大鼠血漿中于37°C孵育一周后損失了20%的載荷，而具有串聯可切割連接子的ADC未觀察到載荷損失。當在攜帶Granta 519異種移植物的小鼠中進行測試時，使用半胱氨酸偶聯的MC-ValCit-PABC-MMAE與P1' PABC上具有β-葡萄糖醛酸苷部分的ADC在減少腫瘤體積方面表現出幾乎同等的效力。
臨床化學和血液學在第5天和第7天進行評估。研究了骨髓抑制的關鍵指標，即單核細胞、中性粒細胞和嗜酸性粒細胞的水平。用傳統的單切割連接子ADC治療的大鼠的循環單核細胞、中性粒細胞和嗜酸性粒細胞水平顯著降低，而用串聯切割連接子ADC治療的大鼠未顯示任何骨髓抑制證據。事實上，后一組循環單核細胞、中性粒細胞和嗜酸性粒細胞的水平與媒介物對照組相似，這清楚地表明在P1'位用β-葡萄糖醛酸苷部分掩蔽極大地增加了連接子在循環中的穩定性。
除了血漿不穩定性，二肽基連接子通常具有疏水性，可能導致ADC聚集。為了應對這些問題，Bargh等人報道了一種雙酶可切割的3-O-磺基-β-半乳糖連接子，可以通過芳基硫酸酯酶A和β-半乳糖苷酶的連續作用以級聯反應切割。ARSA/β-半乳糖苷酶組合極大地改善了溶酶體選擇性切割。此外，陰離子硫酸基團和半乳糖部分的存在極大地改善了連接子在水介質中的溶解度。3-O-磺基-β-半乳糖連接子系統可用于生成具有高度疏水性載荷的ADC，這些載荷在水介質中容易聚集。
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三、GGFG四肽與豆莢蛋白敏感連接子
1. GGFG四肽-氨基甲氧基連接子
除了流行的肽-PABC系統，另一種肽連接子，包含用于自消除性藥物釋放的氨基甲氧基，已成功用于DS8201的開發。1995年，Nogusa等人通過將其氨基基團連接到羧甲基支鏈淀粉上制備了阿霉素的偶聯物。他們證明，當在藥物和多糖聚合物之間放置四肽間隔GGFG時，溶酶體酶有效地釋放了游離阿霉素。當肽間隔是GFGG時，阿霉素仍可被釋放，但程度遠低于GGFG間隔。沒有肽間隔的偶聯物沒有檢測到藥物釋放。他們還表明，偶聯物的抗腫瘤活性與連接子的可切割性平行，GGFG偶聯物活性最高，無間隔基偶聯物活性最低。
在2007年發表的一項研究中，Shiose等人報道了DX8951的大分子前藥，其中聚合物載體羧甲基葡聚糖多元醇通過GGFG四肽間隔基在其氨基基團上與依沙替康偶聯。研究發現，來自溶酶體的組織蛋白酶B、H和L能夠切割甘氨酰-依沙替康酰胺鍵以釋放游離依沙替康。在此基礎上，Ogitani等人開發了一種靶向Her-2的ADC，即DS8201a，以DXd作為載荷。
DS8201a使用半胱氨酸-馬來酰亞胺化學制備，理論DAR為8。DXd中的羥基被用于通過馬來酰亞胺官能化的GGFG-氨基甲氧基連接子進行抗體偶聯。ADC內化后，組織蛋白酶切割GGFG的C端甘氨酸與氨基甲氧基之間的酰胺鍵，觸發后者分解以釋放游離DXd。DS8201a在小鼠、大鼠或人類血漿中表現出良好的穩定性，在21天內僅釋放1-2%的載荷。在后續研究中，Ogitani等人發現DS8201a表現出優異的旁觀者效應，因為依沙替康中的游離胺被羥基乙酰基封閉，DXd載荷不能被質子化電離，因此具有高膜滲透性。DS8201a還被發現是一種非常有效的ADC，針對Her-2低表達的癌癥，這主要歸因于其高DAR為8以及DXd通過細胞膜擴散并殺死附近癌細胞的旁觀者效應。
2. 豆莢蛋白敏感連接子
豆莢蛋白敏感連接子是一類利用豆莢蛋白酶特異性切割的肽序列，將抗體與細胞毒性藥物連接起來的ADC連接子設計。豆莢蛋白是一種在癌細胞中高表達、并在腫瘤侵襲和轉移中起關鍵作用的天冬酰胺內肽酶，主要存在于溶酶體中。其過度表達的特性使其成為設計蛋白酶可切割連接子的有吸引力的靶點。
在設計上，這類連接子通常包含能被豆莢蛋白特異性識別的肽序列（例如含有天冬酰胺的序列），并在其基礎上結合自消除間隔基（如PABC），以實現細胞內的高效藥物釋放。研究已證實，含有AlaAlaAsn等序列的連接子可被豆莢蛋白有效切割，從而作為前藥釋放活性載荷。通過高通量篩選等方法，研究人員還發現了其他Asn相關的二肽序列（如AsnAsn、AsnAla等）對豆莢蛋白具有選擇性，并且在小鼠血漿中表現出良好的穩定性。與傳統的組織蛋白酶可切割連接子相比，豆莢蛋白敏感連接子旨在提供另一種具有潛在更高腫瘤選擇性的裂解機制。
當前，這類連接子正受到ADC開發領域日益增長的關注，是連接子技術多樣化發展的重要方向之一。
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結語
溶酶體可切割肽連接子是ADC技術發展的核心組成部分，其設計優化直接關系到藥物的療效、安全性與治療窗口。從經典的ValCitPABC到新興的串聯可切割連接子、GGFG四肽系統以及對豆莢蛋白敏感連接子的探索，該領域的研究始終圍繞著提高血漿穩定性與增強溶酶體特異性切割效率這兩個核心目標展開。通過理性設計，如在P3位引入酸性氨基酸、優化P1位殘基、對PABC苯環進行親水性修飾等策略，已經顯著改善了連接子的性能。未來，隨著對溶酶體蛋白酶生物學理解的加深以及新的工程化策略（如條件性激活連接子）的出現，ADC連接子將繼續朝著更精準、更安全、更有效的方向發展，從而為癌癥患者帶來更多獲益。
參考資料：
1.Lysosomal-Cleavable Peptide Linkers in Antibody-Drug Conjugates. Biomedicines. 2023 Nov 16;11(11):3080.
原文標題 : ADC中的酶可切割肽連接子
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