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引言

在單克隆抗體藥物開(kāi)發(fā)過(guò)程中，會(huì)經(jīng)歷各種各樣的降解和修飾途徑，比如氧化、聚集、脫酰胺化等等，需要我們時(shí)刻關(guān)注。每個(gè)抗體都有自己的目標(biāo)產(chǎn)品概況，也就是它最終要達(dá)到的那個(gè)理想狀態(tài)。而我們的制劑開(kāi)發(fā)，就是要找到一個(gè)合適的配方，讓這個(gè)抗體能夠穩(wěn)穩(wěn)地達(dá)到并保持這個(gè)目標(biāo)狀態(tài)。怎么知道穩(wěn)不穩(wěn)定呢？這就得靠各種分析方法來(lái)評(píng)估它的穩(wěn)定性，然后才能給它定個(gè)保質(zhì)期。

說(shuō)到單克隆抗體的分析工具，色譜法絕對(duì)最常用的工具之一，特別是HPLC和升級(jí)版的UHPLC。它們就是精密的蛋白質(zhì)探測(cè)器，可以發(fā)現(xiàn)那些化學(xué)上的小變化，比如哪里被氧化了，哪里脫酰胺化了，或者電荷發(fā)生了什么變化。這些變化通常會(huì)影響蛋白質(zhì)的極性或電荷，可以被HPLC檢測(cè)到。那如果蛋白質(zhì)不是自己發(fā)生變化，而是跟別人抱團(tuán)，形成了聚集物呢？這時(shí)候就得靠另一種色譜技術(shù)，尺寸排阻色譜SEC來(lái)分析了。它能根據(jù)分子的大小把它們分開(kāi)，告訴我們樣品里到底有多少單體、二聚體、三聚體，甚至更大的團(tuán)塊。接下來(lái)，我們就具體看看這些色譜方法是怎么工作的。

尺寸排阻色譜

尺寸排阻色譜，簡(jiǎn)稱SEC。它的主要任務(wù)是給蛋白質(zhì)測(cè)尺寸。想象一下，柱子里填滿了帶孔的小珠子，就像一個(gè)篩子。蛋白質(zhì)分子進(jìn)來(lái)后，如果個(gè)頭太大，鉆不進(jìn)孔里，就只能在表面溜達(dá)，跑得快；如果個(gè)頭小，能鉆進(jìn)孔里，甚至鉆得越深，被卡住的時(shí)間就越長(zhǎng)，跑得就慢。通過(guò)比較不同已知大小的標(biāo)準(zhǔn)品跑多快，我們就能估算出樣品中蛋白質(zhì)的表觀分子量。但是要注意，SEC認(rèn)的是蛋白質(zhì)的流體力學(xué)體積，也就是它在水里時(shí)占的空間大小，而不是它真實(shí)的分子量。如果你用一堆標(biāo)準(zhǔn)的球形蛋白來(lái)校準(zhǔn)，去測(cè)量一個(gè)長(zhǎng)得像麻花一樣的蛋白質(zhì)，那結(jié)果肯定不準(zhǔn)。所以，用SEC測(cè)分子量，尤其是對(duì)于那些長(zhǎng)得不規(guī)則的蛋白，得打個(gè)問(wèn)號(hào)。

為了解決SEC測(cè)分子量不準(zhǔn)的問(wèn)題，科學(xué)家們想了個(gè)辦法，給它裝上眼睛，光散射檢測(cè)器。它能在蛋白質(zhì)跑出來(lái)的時(shí)候直接測(cè)量它的實(shí)際分子量，不再依賴于那些球形標(biāo)準(zhǔn)品，算是對(duì)形狀依賴性的一個(gè)重大改進(jìn)。但是，在使用SEC這種方法分析的時(shí)候，還是會(huì)遇到一些挑戰(zhàn)。比如蛋白質(zhì)有時(shí)候不太聽(tīng)話，喜歡粘在柱子上，這就叫非特異性吸附，導(dǎo)致結(jié)果偏低。雖然可以用一些小技巧比如加點(diǎn)異丙醇或者鹽來(lái)減少粘連，但這又可能影響蛋白質(zhì)在水溶液里的真實(shí)行為。還有，不同的抗體在低鹽環(huán)境下表現(xiàn)還不一樣，有的會(huì)跑歪，有的峰形會(huì)變得很難看。另外，蛋白質(zhì)在柱子里被稀釋了，如果它本身在不同濃度下會(huì)抱團(tuán)或散開(kāi)，那測(cè)出來(lái)的結(jié)果就可能不是原始高濃度樣品的真實(shí)情況了。更別提，有些特別大的聚集物可能在過(guò)濾樣品時(shí)就被攔在外面了，導(dǎo)致我們少算了聚集物的比例。所以，光看SEC還不夠，還得用別的方法比如生物物理方法來(lái)交叉驗(yàn)證，確保SEC測(cè)量的準(zhǔn)確性。

離子交換色譜

離子交換色譜，簡(jiǎn)稱IEX。它是專門根據(jù)蛋白質(zhì)表面帶的凈電荷多少來(lái)進(jìn)行分離。在特定的pH環(huán)境下，蛋白質(zhì)上的氨基酸殘基會(huì)帶上正電荷比如賴氨酸、精氨酸、組氨酸或者負(fù)電荷比如天冬氨酸、谷氨酸。IEX柱子內(nèi)部預(yù)先固定了帶相反電荷的基團(tuán)，比如陽(yáng)離子交換柱CEX帶負(fù)電，陰離子交換柱AEX帶正電。當(dāng)樣品流過(guò)時(shí)，帶電荷的蛋白質(zhì)就會(huì)被吸附在柱子上。我們通常在低鹽條件下進(jìn)行，讓蛋白質(zhì)盡可能多地結(jié)合。然后，通過(guò)改變流動(dòng)相的pH值或者逐漸增加鹽濃度，就可以把它們洗脫下來(lái)。理論上很簡(jiǎn)單，在同一個(gè)pH下，帶更多正電荷的蛋白質(zhì)在CEX上會(huì)結(jié)合得更緊，需要更高的pH或鹽濃度才能洗下來(lái)；帶更多負(fù)電荷的蛋白質(zhì)在AEX上結(jié)合得更緊，同樣需要更強(qiáng)的洗脫條件。所以，IEX非常適合用來(lái)追蹤那些改變蛋白質(zhì)凈電荷的修飾，比如脫酰胺化或者琥珀酰亞胺形成，這些都會(huì)改變蛋白質(zhì)的總電荷。

不過(guò)，蛋白質(zhì)并不是簡(jiǎn)單的帶電，它們表面坑坑洼洼，有的地方電荷密集，有的地方稀疏。而且，蛋白質(zhì)還具有柔性。為了最大限度地與柱子上的固定電荷結(jié)合，它可能需要扭動(dòng)身體，調(diào)整自己的姿勢(shì)。但這需要付出能量代價(jià)，有時(shí)候蛋白質(zhì)寧愿不結(jié)合，也不愿意扭曲自己。這就導(dǎo)致實(shí)際的洗脫順序可能跟我們簡(jiǎn)單計(jì)算的凈電荷順序不太一樣。為了解決這個(gè)問(wèn)題，科學(xué)家們發(fā)明了一種新奇的柱子，叫做觸手離子交換色譜。傳統(tǒng)的柱子就像一個(gè)個(gè)小球表面帶電荷，而觸手柱呢，是在基質(zhì)上伸出長(zhǎng)長(zhǎng)的連接臂，把電荷掛在這個(gè)臂膀末端。這樣做的好處是，蛋白質(zhì)可以像握手一樣，輕松地與這些末端的電荷相互作用，而不需要把自己整個(gè)身體都塞到柱子表面去。這大大減少了蛋白質(zhì)構(gòu)象調(diào)整的需求，提高了結(jié)合效率和分辨率。

疏水作用色譜

疏水作用色譜，簡(jiǎn)稱HIC。蛋白質(zhì)表面有些區(qū)域不喜歡水，也就是疏水區(qū)。在高鹽濃度下，水分子會(huì)傾向于圍繞這些疏水區(qū)形成有序的結(jié)構(gòu)，這其實(shí)降低了系統(tǒng)的整體熵，蛋白質(zhì)為了增加熵，就會(huì)傾向于把這些疏水區(qū)藏起來(lái)，減少與水的接觸。HIC柱子上固定了一些小的疏水基團(tuán)，比如苯基或者丙基。在高鹽條件下，蛋白質(zhì)會(huì)被這些疏水基團(tuán)吸引并結(jié)合到柱子上。當(dāng)我們逐漸降低鹽濃度時(shí)，水分子重新占據(jù)主導(dǎo)地位，疏水相互作用減弱，蛋白質(zhì)就被洗脫下來(lái)。一般來(lái)說(shuō)，那些疏水性更強(qiáng)的蛋白質(zhì)，需要更低的鹽濃度才能被洗脫下來(lái)，所以它們?cè)谥�子上停留的時(shí)間更長(zhǎng)。HIC特別擅長(zhǎng)處理那些因?yàn)檠趸�比如色氨酸或蛋氨酸被氧化，或者天冬氨酸異�?gòu)化而改變了表面疏水性的蛋白質(zhì)。

反相色譜

反相色譜，簡(jiǎn)稱RP-HPLC。它跟HIC有點(diǎn)像，也是利用疏水性，但具體方法不太一樣。HIC是靠降低鹽濃度來(lái)減弱疏水作用，而RP-HPLC則是靠往流動(dòng)相里加有機(jī)溶劑，比如乙腈或丙醇。這些有機(jī)溶劑會(huì)取代一部分水，使得蛋白質(zhì)與柱子上疏水基團(tuán)之間的疏水相互作用變得不穩(wěn)定。疏水性強(qiáng)的蛋白需要更高濃度的有機(jī)溶劑才能被洗脫。RP-HPLC最早是用來(lái)分離小分子的，后來(lái)發(fā)現(xiàn)它對(duì)肽段特別有效，特別是結(jié)合質(zhì)譜做肽圖分析，能精確找到蛋白質(zhì)上哪個(gè)氨基酸被修飾了。但是對(duì)于完整的大分子抗體來(lái)說(shuō)，它的分辨率有限。因?yàn)橐粋�(gè)化學(xué)修飾對(duì)整個(gè)大分子的疏水性影響可能沒(méi)那么顯著。但是通過(guò)優(yōu)化，比如選擇合適的柱子、流動(dòng)相和梯度，它還是可以用來(lái)研究某些特點(diǎn)的化學(xué)變化，比如色氨酸的氧化。

       原文標(biāo)題 : 單克隆抗體分析工具：色譜法