HNF4調節脂肪酸氧化，是小鼠腸道干細胞更新所必需的
文章背景簡介
腸上皮細胞具有自我更新和產生分化細胞的能力，每3－5天發生一次更替，這種更替是被活躍的循環干細胞群（其特征是具有Lgr5表達）所推動的。腸道干細胞（又稱為Lgr5＋隱窩基底柱狀細胞或ISCs）及其增殖后代被嵌套在稱為隱窩的杯狀結構中，而管腔投射狀的絨毛完全由分化細胞組成。
營養調節和代謝控制在干細胞生物學中具有重要的作用。研究表明，腸道干細胞（ISCs）對熱量限制和包括脂肪酸、葡萄糖、N－乙酰－D－葡萄糖胺和氨基酸在內的膳食營養素有反應。此前研究表明，LGR5＋細胞特別依賴于線粒體代謝。在ISCs中，脂肪酸氧化能夠刺激氧化磷酸化。這些研究表明，細胞代謝是腸道干細胞穩態的基礎調節因子。然而，目前尚不清楚腸道干細胞獨特的代謝狀態是如何建立的。
由于脂肪酸β－氧化（FAO）是多種組織中干細胞維持的關鍵，因此了解ISCs通過FAO實現自我更新的調節機制是有必要的。肝細胞核因子4（HNF4）有一個保守的配體結合區，能夠與脂肪酸組成性結合在一起。HNF4A是代謝穩態的重要調節因子，參與肝臟脂質代謝基因的轉錄。與酰基－CoA代謝相關的基因被確定為是HNF4A的靶點，HNF4A能夠結合酰基－CoA結合蛋白和脂酰－CoA硫酯。
腸道干細胞與腸道疾病和癌癥相關。了解腸道干細胞（ISC）生理調控機制對人類健康和再生醫學具有重要意義。然而，調控ISC代謝的機制尚不清楚。基于FAO在干細胞維持中的潛在作用以及HNF4在調節脂質代謝過程中的重要性，美國羅格斯大學新澤西人類遺傳學研究所、美國新不倫瑞克新澤西州羅格斯癌癥研究所的Lei Chen， Roshan P． Vasoya， Natalie H． Toke等人研究了HNF4轉錄因子是如何影響ISC代謝，以及HNF4依賴性的代謝調節是否是維持ISC所必需的。該研究于2019年以“HNF4 Regulates Fatty Acid Oxidation and is Required for Renewal of Intestinal Stem Cells in Mice”為題發表在《Gastroenterology》雜志上（IF2018＝19．233，醫學1區）。
所用到的主要方法
1．腸上皮、絨毛和隱窩細胞分離
2．組織學和免疫染色
3． qRT－PCR
4． Western blot
5．類器官培養、計數、免疫熒光
6．FAO活性檢測
7．LC－MS分析
文章主要內容摘要
腸道干細胞（ISCs）的功能受飲食和代謝途徑的調節。肝細胞核因子4（HNF4）是結合脂肪酸的轉錄因子。作者選用Villin－CreERT2、Lgr5－EGFP－IRES－CreERT2、Hnf4af／f和Hnf4gCrispr／Crispr小鼠研究了HNF4轉錄因子的代謝調節機制及在小鼠ISCs中的功能。作者從腸道分離隱窩和絨毛細胞，用帶熒光標記的脂肪酸或葡萄糖類似物孵育，然后通過共聚焦顯微鏡觀察。檢測Hnf4agDKO和對照小鼠近端小腸收集的細胞中脂肪酸氧化活性和三羧酸循環（TCA）代謝產物。此外，作者進行了染色質免疫沉淀和基因表達譜分析，以確定受HNF4因子調控的基因；從十二指腸隱窩提取類器官，用標記的棕櫚酸酯或乙酸酯孵育，檢測TCA代謝產物或脂肪酸的產生；還通過乙酸或二氯乙酸進行了代謝干預。
研究結果表明，隱窩細胞能夠迅速吸收帶標記的脂肪酸，在用FAO（脂肪酸β氧化）抑制劑Etomoxir孵育的類器官中，LGR5＋干細胞標志物（Lgr5、Olfm4、Smoc2、Msi1和Ascl2）的mRNA水平被下調，表明FAO是ISCs更新所必需的。HNF4A和HNF4G在ISCs和整個腸上皮中均有表達。HNF4A和HNF4G的單基因敲除不影響ISCs的維持，但雙基因敲除會導致ISC丟失，致使干細胞不能再生。FAO支持ISC更新，HNF4轉錄因子直接激活Acsl5和Acsf2（編碼長鏈脂酰CoA合成酶）、Slc27a2（編碼脂肪酸轉運蛋白）、Fabp2（編碼脂肪酸結合蛋白2）和Hadh（編碼羥基－CoA脫氫酶）等FAO基因。與對照小鼠相比，Hnf4agDKO小鼠腸上皮FAO基因表達水平、FAO活性和TCA代謝產物均顯著降低，但脂肪酸合成轉錄產物增加。從雙基因敲除小鼠腸道分離的隱窩與乙酸或二氯乙酸共培養能夠恢復腸道干細胞。綜合而言，在小鼠中，轉錄因子HNF4A和HNF4G會調節脂肪酸氧化所需基因的表達，這是腸干細胞更新所必需的。
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