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通過優(yōu)化信號肽構(gòu)建耐熱脂肪酶大腸桿菌高效表達重組系統(tǒng)

2019-10-10 09:47

文章背景簡介

BACKGROUND INTRODUCTION

微生物來源的耐熱脂肪酶常常在大腸桿菌中大量過表達，但是，這些酶通常以低酶活性存在，并且主要以包涵體的形式存在。一些研究指出，將其N末端與信號肽融合、使重組蛋白進行分泌表達，可有效解決這個問題。一般來說，這種方法的可行性在很大程度上取決于信號肽的分泌途徑和要分泌的目標(biāo)蛋白的類型。

中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院Weiqing Zhang等人在2018年在《Microbial Cell FactoriesMicrobial Cell Factories》（IF＝4．402，工程技術(shù)二區(qū)）上發(fā)表了題為“Development an effective system to expression recombinant protein in E． coli via comparison and optimization of signal peptides： Expression of Pseudomonas fluorescens BJ－10 thermostable lipase as case study”的文章。該研究對熒光假單胞菌BJ－10高效分泌耐熱脂肪酶lipBJ10的信號肽進行了比較和優(yōu)化。同時，將該方法與細胞質(zhì)分泌法在分泌可溶性和活性脂肪酶方面進行了比較研究。本文報道的結(jié)果可為其他脂肪酶的高水平表達提供參考。

所用到的主要方法

METHODS

1．雙星膽堿酸法蛋白定量（BCA）

2．實時定量分析

3．形態(tài)計量分析

文章主要內(nèi)容摘要

ABSTRACT

脂肪酶（三酰甘油酯水解酶，E．C．3．1．1．3）可以催化長鏈三酰甘油的水解，在水介質(zhì)中釋放長鏈脂肪酸和甘油。因絕大多數(shù)脂肪酶熱穩(wěn)定性差，野生型菌株產(chǎn)生的脂肪酶產(chǎn)量低，故而嗜熱和耐熱微生物脂肪酶目前需求量很大。本文依據(jù)前期獲得的脂肪酶進行實驗，但該脂肪酶的可溶性較差，所以構(gòu)建了6株攜帶不同融合表達質(zhì)粒的菌株，通過比較這6株菌株的性能，確定了最佳的信號序列，篩選出了最優(yōu)的蛋白信號肽（DsbA）以增強其可溶性蛋白表達。

研究表明使用6個信號肽，即PelB和5個天然大腸桿菌信號肽作為融合伴侶進行融合表達，可以比非融合表達產(chǎn)生更多的可溶性和功能性重組lipBJ10。重組lipBJ10與這六種不同的信號肽融合后，可在大腸桿菌中分泌到細胞周質(zhì)中。所有融合表達的總脂肪酶活性均高于非融合表達。當(dāng)lipBJ10與DsbA融合時，相對活性達到峰值，產(chǎn)生的蛋白活性是非融合蛋白的73．3倍。當(dāng)使用DsbA作為融合伙伴時，活性最高（265．41 U／ml），包涵體的形成最少；其它4個大腸桿菌信號肽在一定程度上會導(dǎo)致活性低且不溶于包涵體。因此，DsbA是與lipBJ10融合的最佳信號肽伴侶，可以有效地生產(chǎn)可溶性和功能性蛋白。與未進行融合的蛋白lipBJ10相比，融合有這些信號肽，特別是DsbA的信號肽，可以顯著減少包涵體的形成，增強lipBJ10的功能和溶解性。