畢赤酵母高效表達熱穩定性褐藻膠裂解酶及其在生產褐藻寡糖的應用
01
文章背景簡介
BACKGROUND INTRODUCTION
褐藻膠是由β－D－甘露糖醛酸（M）及其C5差向異構體α－L－古羅糖醛酸（G）通過α／β－1，4糖苷鍵隨機排列而成的一種酸性多糖，這兩種糖單元相互聚合形成三種不同的結構單元：聚甘露糖醛酸（PolyM）、聚古羅糖醛酸（PolyG）及M和G隨機組合形成的雜聚物（PolyMG）。褐藻膠裂解酶廣泛存在于生長在海水、土壤和海洋藻類的微生物中，以弧菌、假單胞菌、固氮菌、芽孢桿菌、黃桿菌等海洋細菌最為常見，在少數真菌和病毒中也有褐藻膠裂解酶的存在。
褐藻膠裂解酶是一種專性裂解褐藻膠的多糖降解酶，可通過β消除反應切斷酸性褐藻膠多糖糖苷鍵，并在新生成的非還原端C4，5 間產生具有不飽和雙鍵結構的寡糖產物。褐藻膠裂解酶按其對底物降解方式的不同分為多聚α－L－1，4－ 古羅糖醛酸裂解酶、多聚β－D－1，4－ 甘露糖醛酸裂解酶及兩種片段都能裂解的雙功能裂解酶。褐藻膠的降解產物褐藻寡糖在醫藥、農業、食品等領域都具有巨大的利用潛力，有研究表明其在抗氧化、抗腫瘤、抗凝血、抗真菌、神經保護、腸道消化吸收及植物的生長及保鮮等方面表現出良好的生物活性。
畢赤酵母表達系統具有細胞外蛋白分泌能力強、分離方便、無內毒素生成等優點。該系統通常是工業生產重組蛋白的首選，但目前還沒有褐藻膠裂解酶在畢赤酵母系統中重組表達的報道。對畢赤酵母在褐藻膠裂解酶生產中的潛在應用進行研究具有很好的研究價值。
2018年，杭州師范大學的Haifeng Li等人在《Marine Drugs》（IF2018＝4．379，醫學2區）發表了題為“High－Level Expression of a Thermally Stable Alginate Lyase Using Pichia pastoris， Characterization and Application in Producing Brown Alginate Oligosaccharide”的文章。在本研究中，對黃桿菌H63的褐藻酸裂解酶基因sagl在畢赤酵母中成功進行了表達，并獲得了較高的產量。在此之前，由于包涵體問題，sagl基因在大腸桿菌中并沒有得到很好的表達。同時，該研究對酵母生產的重組海藻酸裂解酶的特性進行了詳細的研究。此外，利用該重組酶對褐藻酸寡糖的大規模生產進行了研究。
02
所用到的主要方法
METHODS
1．大腸桿菌和畢赤酵母重組表達；
2．SDS－PAGE；
3．Western blot；
4．去糖基化；
5．TLC薄層色譜；
6．ESI－MS；
7．氨基酸系統發育樹構建與分析
03
文章主要內容摘要
ABSTRACT
本文將來源于黃曲霉H63的褐藻膠裂解酶基因sagl在密碼子優化后在畢赤酵母中通過高密度發酵實現高表達，在酵母培養上清中sagl（rSAGL）重組酶的最高產量達到226．4 μg／mL（915．5 U／mL）。這是迄今為止海藻酸鈉裂解酶重組表達的最高產量。rSAGL通過EndoH消化證實為部分糖基化蛋白。該酶的最佳反應溫度為45°C、最適pH為7．5；在80 mM K＋濃度下最多可使酶的催化活性提高244％。rSAGL是一種熱穩定酶，T5015為57～58°C，T5030為53～54°C，其熱穩定性優于任何已知的海藻酸鈉裂解酶。在pH為6的100 mM磷酸鹽緩沖液中，rSAGL在50°C孵育2h后可保留98．8％的初始活性，在同樣溫度48 h后仍可保留初始活性的61．6％。通過畢赤酵母生產純化后的rSAGL的特異活性可達到4044 U／mg，這是迄今為止海藻酸鈉裂解酶的第二高記錄。當rSAGL粗酶直接用于轉化40 g／L的海藻酸鈉，在50℃培養32小時后，可以將97．2％的底物轉化成二、三、四糖。混合物中還原糖的最終濃度達到9．51 g／L。這是首次利用畢赤酵母系統高表達熱穩定的褐藻膠裂解酶。
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